環氧乙烷(ethylene oxide, EO)具有成本低、低溫低濕以及穿透性強的優勢,廣泛應用于一次性無菌醫療器械的滅菌[1][2][3]。但EO是一種中樞神經抑制劑,與皮膚接觸后會迅速發生紅腫,若長期接觸,會造成神經衰弱綜合征和植物神經功能紊亂[4,5][4,5],美國國家衛生研究院已將EO歸為“已知的人類致癌物”[6]。為保障醫療器械使用的安全性,對于環氧乙烷滅菌的產品,EO殘留量是必檢項目。

與此同時,醫療器械產品經EO滅菌后,在存儲、運輸、使用等環節,殘留的EO還存在生成其他副產物的可能。一方面,若殘留的EO發生水解,進而與產品本身或環境中的氯離子反應生成2-氯乙醇(ethylene chlorohydrin, ECH)[7]。ECH是一種刺激體表、具有急性毒性,并且可以通過皮膚快速吸收的易燃性液體[8]。ECH具有輕微的致突變性,存在對肺、腎、中樞神經系統和心血管系統造成損傷的風險[8]。另一方面,若殘留的EO與水反應,則會生成乙二醇(ethylene glycol, EG)。雖然EG性質穩定,不易揮發且毒性較低,但EG的代謝產物為乙醛酸和草酸。二者對人體的毒性較高,乙醛酸會抑制三羧酸循環,草酸則能引起代謝性酸中毒和腎損傷[9]。

目前,針對EO、ECH和EG 3種物質的單獨檢測,多采用氣相色譜法(gas chromatography, GC)[10][11]和氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[12][13][14][15]。例如,閆順華等[16]建立了頂空-氣相色譜法檢測口罩、防護服等醫療防護用品中EO的殘留量,其方法檢出限可以達到0.1 mg/kg。付步芳等[17]建立了GC-MS分析ECH殘留量,并對經皮經動脈血管成形術(PTA)球囊擴張導管的ECH殘留量水平進行了安全性評價。范晨亮等[18]建立了測定工業用EG純度及其中有機雜質的氣相色譜方法,可滿足工業化分析乙二醇純度和雜質的基本要求,在乙二醇生產控制、產品檢測等方面具有良好的應用前景。

在同時檢測方面,現有的研究文獻多集中于EO和ECH二者的共同測定,且多集中在食品和藥品領域[19][20][21][22]。例如,周靜等[23]采用頂空-氣相色譜-質譜技術,實現了對乳及乳制品(液態乳、發酵乳、嬰幼兒配方乳粉、冰淇淋)中EO和ECH的準確定性和定量。周云婷等[24]采用氣相色譜法建立了同時測定EO和ECH殘留量的方法,可用于明膠空心膠囊中EO和ECH的同時控制。

目前尚未檢索到同時測定醫療器械產品中EO、ECH和EG的相關報道。與此同時,現行標準尚無適用于醫療器械產品的EO、ECH和EG的同時檢測。因此如何實現3種物質的快速有效檢測對醫療器械的監管檢測意義重大。

本文基于氣相色譜法建立了同時快速測定EO、ECH和EG殘留量的分析方法,并采用建立的方法對典型一次性使用無菌醫療器械產品進行了3種物質殘留量的檢測,可為醫療器械相關產品中環氧乙烷殘留物質的判斷提供技術評價依據,為監管部門的監督檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

8890B氣相色譜儀(美國Agilent公司),配有HA-300氫空一體機(北京中惠分析技術研究所)和7693A液體進樣器(美國Agilent公司); Milli-Q超純水機(美國Millipore公司); MS104TS電子天平(美國Mettler Toledo公司); SHP080生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

EO標準品(質量濃度為 50 000 mg/L)購自上海安譜璀世標準技術服務有限公司;ECH標準品(100 mg/支)購自美國Panphy Chemicals公司;EG標準品(色譜純)購自上海阿拉丁試劑有限公司;乙醇(色譜純)、丙酮(分析純)均購自天津市科密歐化學試劑有限公司,乙腈(色譜純)購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

本試驗醫療器械產品檢測階段涉及以下產品,均經EO滅菌。按產品主要實驗部位材質分類如下:聚氯乙烯材質,一次性使用鼻氧管、一次性使用濕化鼻氧管、一次性使用吸氧管、一次性使用濕化吸氧管、一次性使用聚氯乙烯導尿管、一次性使用無菌組織沖洗器、一次性使用輸液器、一次性使用輸液器(帶針);高分子硅橡膠材質,一次性使用子宮測量管;聚丙烯材質,一次性醫用包布、一次性使用無菌包布;聚乙烯材質,一次性使用超低密度聚乙烯輸液器;硅膠材質,一次性使用硅膠導尿管;熱塑性彈性體材質,一次性使用輸液器;聚苯乙烯材質,一次性使用無菌陰道擴張器。

1.2 標準溶液的配制

1 000 μg/mL 混合貯備液配制:精密量取2.0 mL 的EO標準品,精密稱重100.0 mg ECH標準品和100.0 mg EG,置于100 mL容量瓶中(已加約80 mL乙醇),用乙醇稀釋至刻度。

將 1 000 μg/mL 的混合貯備液用乙醇逐級稀釋,得到質量濃度為0.15、0.30、0.60、1.20、1.50、3.00、6.00、10.00 μg/mL 的混合標準溶液。分別取15種未經環氧乙烷滅菌的產品樣品2.5 g,依次加入各濃度混合標準溶液5.0 mL,于40 ℃下放置4 h,將樣品與液體分離,過濾后取1.0 mL溶液于樣品瓶中,立即密封,得到含量分別為0.30、0.60、1.20、2.40、3.00、6.00、12.00、20.00 μg/g 的EO、ECH與EG的基質校對標準溶液。

1.3 樣品浸提液制備

取包裝完整的一次性使用無菌醫療器械產品,剪成約5 mm長碎塊;其中一次性醫用包布、一次性使用無菌包布和一次性使用無菌陰道擴張器剪成約0.5 cm2碎塊。取樣品2.5 g于25 mL具塞玻璃比色管中,加入5.0 mL乙醇后密封,于40 ℃下浸提4 h,將樣品與液體分離,過濾后取1.0 mL浸提液于樣品瓶中,密封。平行制備2份。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱:DB-WAX(30 m×0.53 mm×1.0 μm);柱溫升溫程序:40 ℃保持5 min, 40 ℃/min 升溫至120 ℃,保持5 min, 6 ℃/min 升溫至200 ℃,保持2 min;進樣口溫度:200 ℃;檢測器溫度:300 ℃;載氣:氮氣,流速:3 mL/min;分流比:5∶1。

2 結果與分析

2.1 進樣方式的選擇

EO的沸點低、易揮發,適用于頂空進樣方式進行測定[12]。ECH具有一定的揮發性,而EG沸點高不易揮發,若采用頂空進樣的方式,容易因為平衡溫度過高而使頂空瓶內氣壓過大導致破裂。因此,液體直接進樣的方式更適用于三者的同時檢測。

2.2 氣相色譜柱的選擇

目前,關于環氧乙烷殘留物質的測定,文獻中普遍選用的色譜柱有強極性柱HP-INNOWAX[14,15][14,15]、DB-WAX[9]和中等極性柱DB-624[10,22,24][10,22,24][10,22,24]。分別考察了HP-INNOWAX(60 m×0.53 mm×1.0 μm)、DB-WAX(30 m×0.53 mm×1.0 μm)和DB-624(30 m×0.53 mm×3.0 μm)3種色譜柱對殘留物質的分離效果。結果發現,3種物質在DB-WAX色譜柱上響應值較高,峰形良好,分析時間較短且分離效果最好(見圖1)。因此,選擇DB-WAX對一次性使用無菌醫療器械產品進行EO、ECH與EG殘留量的測定。

2.3 浸提條件的選擇

分別考察了浸提介質、浸提溫度、浸提時間和取樣量對檢測結果的影響。

2.3.1浸提介質的確定

目前文獻中測定EO、ECH與EG的浸提介質有水、乙醇、丙酮和乙腈等[9,11,20,24,25][9,11,20,24,25][9,11,20,24,25][9,11,20,24,25][9,11,20,24,25]?？紤]到ECH在水中不穩定[26],且EO遇水易生成EG,干擾EO和EG的真實含量;同時,當水作為浸提介質直接進樣時,可能會出現襯管過載、色譜柱分離度和重現性差等問題,故水作為浸提介質不適用于這3種物質的測定。

取經驗證含EO、ECH和EG的一次性使用輸液器樣品2.5 g,依次以乙醇、丙酮和乙腈作為浸提介質,按1.3節下操作制備樣品浸提液并測定。結果發現,丙酮由于沸點較低,揮發過快,無法實現產品浸提;且丙酮屬于易制毒試劑,故不選用。經乙醇和乙腈浸提的測定結果見圖2,相比于乙醇而言,乙腈作為浸提介質時浸出雜質過多,容易干擾目標物質測定。此外,乙醇具有成本低、毒性小的優勢,故選用乙醇作為浸提介質。

2.3.2浸提溫度和浸提時間的確定

考察了浸提溫度和浸提時間對3種殘留物質浸提量的影響(見圖3)。取經驗證含EO、ECH與EG的一次性使用輸液器,分別于20、30、40和50 ℃溫度下浸提0.5、1、2、3、4、5、7、9、10 h。

由圖3可知,沸點差異較大的3種目標物質所展現出的浸提規律具有明顯的差異。首先,針對低沸點的EO而言,隨著浸提時間的延長,各溫度條件下浸提量整體呈現下降趨勢,說明對于沸點低的EO,不宜進行長時間的浸提。在20～40 ℃的浸提溫度區間內,EO整體浸提量:40 ℃>30 ℃>20 ℃,表明一定范圍內溫度的提高有助于促進EO的浸提效果。但當溫度在50 ℃時,較高的溫度會促使EO從浸提介質乙醇中逸出,浸提量反而降低。

其次,對于沸點介于EO和EG之間的ECH而言,隨著浸提時間越長,其峰面積先增大后趨于穩定。另外,在浸提開始階段,浸提溫度越高,ECH峰面積的增大速率越快,說明溫度有助于提升ECH的浸提速率。當浸提溫度為40 ℃,浸提時間為4 h時,ECH的浸提量最大。

對于沸點高的EG而言,各溫度條件下,其峰面積隨浸提時間延長均呈現逐漸增大的趨勢,由于其沸點較高不易揮發,浸提量隨浸提時間延長而增大。40 ℃下EG整體浸提量均高于其余溫度條件,4 h后其浸提速率放緩。3種物質的浸提規律并非僅受溫度或時間單因素的影響,物質之間的相互作用有待進一步探究。

為同時實現3種目標物質較好的浸提效果,最終選擇40 ℃下平衡4 h。

2.3.3樣品質量的確定

取經驗證含EO、ECH與EG的一次性使用輸液器進行分析,分別向具塞玻璃比色管中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 g樣品,按1.3節操作平行制備浸提液3份,使用1.4節的儀器條件進行測定。以樣品質量為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制曲線圖(見圖4)。

結果發現,EO、ECH與EG峰面積整體趨勢是隨著樣品質量的增大而增大,但只有ECH的峰面積與樣品質量呈線性增加關系,而對EO和EG而言,隨樣品質量增大,峰面積增加速度先快后慢,分別在樣品質量為3.0 g和2.5 g后峰面積緩慢增加。這表明在3種物質共存的體系中,浸提量與樣品質量之間并非簡單的線性關系,物質之間存在相互影響。但考慮到當樣品質量大于2.5 g時,樣品所占的體積較大,乙醇不能完全浸濕樣品表面,不能代表樣品中3種物質的真實殘留量,因此最終確定樣品質量為2.5 g。

2.4 線性關系、檢出限和定量限

將1.2節配制好的基質校對標準溶液按1.4節儀器條件進行測定,以保留時間定性,分別以標準物質的含量為橫坐標(X, μg/g)、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得到不同產品的EO、ECH與EG的線性方程和相關系數(r)。以3倍和10倍信噪比分別確定各產品的檢出限和定量限[21],相關數據見表1。結果表明,3種物質在線性范圍內線性關系良好,在不同樣品中的檢出限為0.10～0.40 μg/g,定量限為0.30～1.20 μg/g。該方法線性范圍寬,靈敏度高。

2.5 回收率和精密度

分別取15種未經環氧乙烷滅菌的產品樣品2.5 g,在1.20、2.40、12.00 μg/g 3個加標水平下加入標準溶液5.0 mL,于40 ℃下放置4 h,將樣品與液體分離,過濾后取1.0 mL溶液于樣品瓶中,每個添加水平重復測定6次,通過加標回收試驗考察方法的準確度,結果見表2。EO、ECH與EG 3種物質的平均回收率為91.08%～116.08%, RSD為0.56%～8.45%。該方法準確度及精密度良好,滿足檢測要求。

2.6 醫療器械產品檢測

選取經環氧乙烷滅菌的15種一次性使用醫療器械產品進行測定,結果見表3。共5個樣品檢出EO,為一次性使用鼻氧管、一次性使用無菌組織沖洗器、一次性使用輸液器(帶針)、一次性使用無菌包布和一次性使用醫用包布,以上樣品的EO殘留量均小于10 μg/g,但不同樣品的EO殘留量相差較大,這可能是由于樣品間材質差異造成的,不同材質對環氧乙烷的吸收、保持和釋放能力有顯著差異[8]。EO殘留量的差異進而會影響ECH與EG的殘留量。其次,H廠家的一次性使用輸液器(帶針)同時檢出了3種殘留物質,而G廠家的一次性使用輸液器中均未檢測到目標物質,表明不同廠家之間該類產品存在差異,應著重關注該類產品環氧乙烷相關殘留物質的檢測,降低安全風險。此外,非聚氯乙烯材質的樣品均未檢出ECH,這可能是由于樣品原材料不含氯離子,同時在生產規范的情況下,其他途徑未引入氯離子[17]。

3 結論

本文基于氣相色譜法建立了同時快速測定環氧乙烷滅菌的醫療器械產品中EO、ECH和EG殘留量的分析方法,并利用該方法對經環氧乙烷滅菌的一次性使用輸液器和一次性使用鼻氧管等共15批次的一次性使用醫療器械產品進行了測定。檢出EO、ECH與EG存在不同程度的殘留。該方法操作簡單,定量準確,重復性好,完全可滿足實際EO、ECH與EG殘留量的檢測需求,有助于科學有效地評價一次性使用無菌醫療器械產品中環氧乙烷殘留物質的風險,對于提高醫療器械質量、保證器械使用安全十分必要,為監管部門的監督檢測提供參考。